Optica y Microscopia

La óptica es el estudio de la interacción de las ondas de luz con medios reflectores y medios refractores.
• La luz es una manifestación de la energía universal que se desplaza por ondas y que no necesita medio elástico para su transporte (la longitud de onda es de 0,7 y 0,31 micras y tiene una velocidad de 300.000 Km x segundo).
• La intensidad de la luz está en relación inversa al cuadrado de la distancia.
• Los Arabes fueron los primeros en descubrir el cristalino, mientras que Alhazam fue el primero en publicar un libro llamado “Los tesoros de la vista”.
• Lippershey fue el que tallando lentes inventó el microscopio, y a partir de este Galileo lo mejoró. Sensación Luminosa
• El sentido de la vista nos pone en comunicación con el medio exterior, proporcionándonos sensaciones de forma, color distancia de los objetos que nos rodean, por la acción que ejercen en nuestros ojos ciertas radiaciones.
• Los cuerpos que emiten o producen radiaciones capaces de impresionar nuestro sentido de la vista se llaman fuentes luminosas.
• Los cuerpos que reflejan la luz que recién de ella
la que de ese modo llega a nuestros ojos en forma indirecta se dicen que están iluminados.
El color es una característica de impresión luminosa.
Las fuentes luminosas pueden:
- naturales
- artificiales.
• Los cuerpos que interpuestos ente el ojo y los objetos permiten percibir sin modificación sensible las sensaciones luminosas son transparentes
La luz se propaga en forma recta si el medio es homogéneo.
• El rayo luminoso es la radiación que ha pasado por un pequeño orificio si la fuente de luz esta alejada.
• El conjunto de rayos que pasa por un punto consiste en un haz de rayos.
• La propagación rectilínea de la luz se cumple siempre que los objetos interpuestos o las ranuras por donde se las hace pasar no sean pequeños pues entonces se produce la difracción.


REFLEXION Y REFRACCION EN SUPERFICIES PLANAS. Reflexión de una onda plana en una superficie plana

• Para el mejor entendimiento de lo que es una reflexión de una onda plana en una superficie plana, veo conveniente la explicación de esta mediante su gráfica.
• Consideramos la traza AA’ (Fig. 1) de un frente de onda plano que acaba de hacer contacto con la superficie reflectante MM’, a lo largo de una recta que pasa por A, perpendicular al plano del dibujo. Los planos del frente de onda y de la superficie reflectante son también normales al de la figura.
• La posición del frente de onda, al cabo de un intervalo de tiempo t, puede hallarse aplicando el principio de Huygens.
• Con puntos situados sobre AA’ como centros, se
dibuja cierto número de ondas secundarias de radio vt, siendo v la velocidad de propagación en el medio situado encima de la superficie.
• Las ondas secundarias engendradas junto al extremo superior de AA’ se propagan sin obstáculos, y su envolvente da la porción OB’ del nuevo frente de onda; pero las ondas secundarias engendradas junto al borde inferior de AA’ inciden
sobre la superficie reflectante.
• Si esta no existiese, habrían ocupado las posiciones representadas por los arcos de circunferencia señalados con trazos.
• El efecto de la superficie reflectante es invertir el sentido de propagación de las ondas que inciden sobre ella, de modo que la parte de una onda secundaria que hubiera penetrado debajo de la superficie, se encuentra realmente sobre ella, como indican las líneas de trazo lleno.



Posiciones sucesivas de una plana AA’ al reflejarse en una superficie plana.
• La envolvente de estas ondas secundarias reflejadas forma la porción OB del frente de onda,
y la traza del frente completo en ese instante es la quebrada BOB’. Una construcción análoga da la línea CPC’, que es el frente de onda después de otro intervalo t.
• El ángulo formado por la onda incidente y la superficie se denomina ángulo de incidencia;



• El ángulo r que forma la onda reflejada con la superficie se llama ángulo de reflexión.
• Para obtener la relación entre estos ángulos, consideremos la figura 2, que es una parte de la fig. 1.
• Desde O se traza OP = vt, perpendicular a AA’. Ahora bien: OB es por construcción, tangente a una circunferencia de radio vt, con centro en A. Por consiguiente, si se traza el segmento AQ que une A con el punto de tangencia, los triángulos APO y AQO son iguales. (Triángulos rectángulos con el lado AO común y AQ = OP.)
• En consecuencia, el ángulo es igual al ángulo r,
y tenemos la ley de la reflexión «Una onda plana se refleja en una superficie plana formando un ángulo de reflexión igual al de incidencia». Refracción de una onda plana en una superficie
plana
• Siempre que un tren de ondas luminosas que se propongan en un medio transparente, incide en la superficie de un segundo medio transparente cuyo índice de refracción difiere del correspondiente al primero (esto es, en el cual la velocidad es distinta
a la del primero), se originan en la superficie de separación dos nuevos trenes de ondas.
• Uno de ellos, que constituye la onda reflejada, vuelve al medio inicial, mientras el otro, llamado onda refractada, se propaga en el segundo medio.
• La dirección de la onda reflejada viene dada por la ley de la reflexión deducida en la sección anterior.
• Procedamos ahora a obtener la dirección de propagación de la onda refractada.



• Consideramos la traza de un frente de onda plano AA’ (Fig. 3), que acaba de hacer contacto con la superficie MM’ a lo lago representa la superficie de separación de dos medios transparentes de distinto índice de refracción.
• Sea n el índice del medio situado encima de MM’
y n’, el del medio inferior. Supongamos n’>n. Las ondas reflejadas no están representadas en la figura, pues se comportan exactamente igual que
en la figura 1.
• Apliquemos el principio de Huygens para hallar, al cabo del tiempo t, la posición del frente de onda refractado.
• Tomando puntos situados sobre AA’ como centros, se dibuja cierto número de ondas secundarias.
• Las engendradas cerca del borde superior de AA’ se propagan con la velocidad v = c/n, y al cabo de un intervalo de tiempo t son superficies esféricas de radio vt. Sin embargo, la onda secundaria que se origina en el punto A se propaga en el medio inferior con la velocidad v’ = c/n’ y al cabo del tiempo t es una superficie esférica de radio v’t.
• La envolvente de las ondas secundarias procedentes del frente de onda inicial son dos planos cuyas trazas forman la línea quebrada BOB’.
• Una construcción análoga conduce a la traza
CPC’, al cabo de un segundo intervalo de tiempo t.
• Los ángulos y ‘ formados por la superficie y los frentes de onda incidente y refractado se denominan, respectivamente, ángulo de incidencia
y ángulo de refracción.



• Para hallar la relación entre estos ángulos utilizaremos la figura 4 que es una parte de 3. Se trazan OQ = vt, perpendicular a AQ y AB = v’t, perpendicular a BO. Del triángulo rectángulo AQO, se deduce

senø= v't/AO

Por tanto,

senø = v / senø' v'

• Esto es, cuando un tren de ondas planas incide
sobre la superficie de separación de dos transparentes, la razón del seno del ángulo de incidencia al seno del ángulo de refracción es igual a la razón de las velocidades de propagación en los dos medios.
Dado que por definición,

n= c/v y n'= c/v'

siendo c la velocidad de propagación en el vacío, se deduce que:

v/v'= n'/n

y la Ec. 1 puede escribirse,

senø/senø' = n'/n

o bien,

n sen ø = n’ sen ø’

• Esta ecuación es más útil que la 1, ya que el índice de refracción de una sustancia es el dato que figura habitualmente en la tablas, en lugar de la velocidad de propagación de la luz en dicha sustancia.
• Como para un para de sustancias dadas la razón n’/n es constante, la Ec. 2 equivale a:

sen ø/ sen ø'= constante

• El descubrimiento de que la razón del seno del
ángulo de incidencia al seno del ángulo de refracción es constante se atribuye habitualmente a Willebrod Snell, en 1621, aunque parece ser algo dudoso su fue realmente realizado por él. De acuerdo con la costumbre, denominaremos ley de Snell a la representada por la ecuación # 2 anteriormente descrita.
• En ambos los rayos se reflejan de una manera divergente donde se forma imagen virtual y en los convergentes se forma imagen real.

Refracción
• Es el cambio de dirección que experimenta la luz
al pasar de un medio a otro.

Reflexión
• Es cuando los rayos de luz llegan al objeto y son reflejados en dirección diferente; pero con el mismo ángulo de inclinación.

Leyes de refracción
1.- El seno del ángulo incidente y del ángulo de
refracción es una relación constante.
2.- El ángulo del rayo incidente y el ángulo de refracción son una relación constante pero además son coplanares.


LEYES FUNDAMENTALES DE LA OPTICA
1. La luz se propaga en línea recta.
2. Si con una pantalla se intercepta una parte del haz de rayos, los rayos restantes no modifican su trayectoria ni se modifican.
3. Un rayo que llegue a la superficie de separación de dos medios (rayo incidente) se divide en otros dos.
• Uno vuelve al primer medio y los otro se
propaga al segundo si el otro es transparente.
• La ley de refracción nos dice que rayo que vuelve al primer medio reflejado se mantiene en el plano determinado por el rayo incidente y el ángulo de reflexión es igual al ángulo de incidencia.
• El rayo que pasa al segundo medio o rayo refractado y forma en el mismo plano un ángulo. LUZ
• Esta compuesta de pequeñas partículas llamadas fotones, y que están dotadas de movimientos vibratorios.
• Es una forma de energía radiante, cuya longitud de onda es 0,2 a 0,8 micras. luz blanca. REFRACCION
• Este fenómeno se produce cuando el objeto es transparente y consiste en la desviación que sufre el rayo luminoso al atravesar un cuerpo transparente.
• El índice de refracción es la medida de la densidad óptica de un objeto
REFLEXION
• Consiste en que el rayo luminoso es desviado por un cuerpo en una sola dirección.
ESPEJO
• Una superficie perfectamente plana es un espejo
• Todos los rayos que partiendo de un punto S, (sus prolongaciones) se reflejan en un espejo,
pasan por un punto S‘ simétrico de S con respecto al plano del espejo.
• Al punto S‘ lo llamaremos imagen de S como son prolongaciones de rayos reflejados esta imagen tiene carácter virtual.
• La imagen real es aquella en el los rayos y no sus prolongaciones se cortan en un punto..
• Si en lugar de uno solo, tenemos varios puntos, a cada punto objeto corresponderá uno imagen.
• Como la imagen es simétrica del cuerpo con respecto al plano del espejo la imagen es virtual y de igual tamaño siendo simétricas no se pueden superponer por eso la imagen de mano derecha es una mano izquierda.
• Si el haz de rayos que incide sobre un espejo converge hacia un punto situado detrás del mismo el centro del haz constituye un foco virtual y su imagen será en este caso real. ESPEJOS ESFERICOS
• Cuando el espejo tiene la forma de un arco de esfera y la superficie de reflejo corresponde a la cara interior se llama cóncavo y si corresponde a la cara exterior se llama convexo.
TIPOS DE LENTES
• Pueden ser biconvexas, plano convexas, bicóncavas, cóncavas y cóncavo convexas.
• Si el índice de refracción es mayor que el medio que la rodea son convergentes.
• Las cóncavo convexas son convergentes o divergentes según la cara de mayor curvatura sea la convexa o la cóncava.
DIOPTRIA
• La superficie plana de separación de dos medios de distinto índice de refracción separados uno de otro por una superficie esférica constituye una dioptría esférica.
• Un medio transparente limitado por dos dioptrías cuyos ejes principales coinciden constituyen una lente.
El eje principal
• Es la recta que pasa por el centro y el vértice de la superficie esférica.
El foco principal imagen
• Todos los rayos que incidan paralelamente eje principal provengan de un objeto infinitamente alejado del mismo se refractara y todos los rayos del haz pasaran por un punto del Eje principal.
• Es el punto del eje principal que es la imagen de un punto infinitamente alejado sobre el mismo eje.



OBTENCION DE IMAGENES EN LA DIOPTRIAS Tomaremos con referencia tres rayos:
1) El rayo paralelo al eje principal que se refracta
y pasa por el foco principal
2) Un rayo que pasa por el centro de curvatura no se desvía
3) un rayo que pasa por el objeto y sale paralelo al eje principal.
• En dioptrías convergentes se han obtenido imágenes reales.
Foco principal objeto
• Es el punto del eje principal tal que los puntos que pasan por el emergen paralelos al eje principal.


CASOS DE LA FORMACION DE IMAGENES
PRIMER CASO
El objeto iluminado se encuentra en el infinito, la imagen se encuentra reducida a un punto que se encuentra en el foco principal.



SEGUNDO CASO
El objeto esta entre el infinito y el centro de curvatura es una imagen invertida y de menor tamaño.



TERCER CASO
El objeto esta en el centro de curvatura y por lo tanto da una imagen real y del mismo tamaño.



CUARTO CASO
El objeto se encuentra entre el centro de curvatura y el foco principal, forma una imagen real, invertida y de mayor tamaño que el objeto.



QUINTO CASO
El objeto se halla en el mismo foco principal, los rayos refractados salen paralelos al eje principal por lo tanto no forma imagen ni real, ni virtual pues los rayos se prolongan en el infinito.



SEXTO CASO
El objeto esta entre el foco principal y la lente, se observa una imagen virtual derecha y de mayor tamaño que el objeto, pero en el mismo lado de la lente en el que se halla el objeto.




MICROSCOPIA
• La palabra microscopio viene de micro y del gr. Skopein = mirar, examinar.
• El microscopio es un instrumento óptico que sirve para aumentar considerablemente la imagen de los objetos muy diminutos.
• La Microscopía va a estudiar a las partes más pequeñas a través del microscopio (el más común: microscopio óptico) Sus áreas de la Microscopía son:
a) Organografía Estudio de los órganos.
b) Histología (propiamente dicha, tejidos)
c) Citología o biología celular.

Partes del microscopio óptico.
MICROSCOPIO DE LUZ
Con el microscopio de luz las preparaciones teñidas son observadas por transiluminación.
El microscopio está compuesta de una parte mecánica y una parte óptica.
• El microscopio va a tener una parte mecánica y un sistema de lentes.
• Entre ellas podemos encontrar al pie o pedestal
que va a adquirir diversas formas; una de puede ser circular, cuadrada, rectangular y semilunar.
• También va a estar compuesto por el tornillo macrométrico (enfoca la imagen) y por el micrométrico (afina la imagen); ambos tornillos se van a encontrar en el asa o brazo del microscopio;
y por el otro lado vamos a encontrar al porta objetos, carro de movimientos que nos van a permitir deslizar el porta objetos para abajo, arriba y a los costado.
• Las pinzas van a ir a sostener a la lámina porta
objetos.
• En la parte del portaobjetos vamos a tener al nonios overmier que nos dará el tamaño.
- Identificar los componentes de la parte mecánica.
- La parte óptica esta compuesta por tres sistemas de lentes.
• En cuanto a la parte óptica el microscopio va a usar lentes convergentes: plano convexa, biconvexa, concavoconvexa.
- condensador
- Objetivos
- Oculares
• El condensador proyecta un rayo cónico de luz para iluminar el objeto a ser observado.
• Los objetivos aumentan el tamaño de la imagen
y la proyectan en dirección de los lentes oculares.
• El ocular aumenta mucho más la imagen y la proyecta a la retina del observador o a las pantallas.
• El grado de aumento se obtiene multiplicando el poder de aumento de los objetivos por los de los oculares.
Resolución
• El factor crítico para obtener una buena imagen microscópica es la resolución que es la distancia más pequeña entre dos partículas que se puedan distinguir.
• Dos partículas que estén a una distancia de
0,3um pueden observarse separadas si el factor de resolución es menor, si aumenta este factor solo se observan como un único punto. (los mejores microscopios tienen un factor de resolución de 0,2um)
• La claridad, y mientras más detalles permita observar indican la calidad del microscopio.
• El aumento depende del poder de resolución. depende de los objetivos. Los oculares no aumentan la resolución y solo la magnifican. Apertura Numérica
• Una de las mayores características de un objetivo es su apertura numérica (NA).
• Para la resolución es una función de la apertura numérica y de la longitud de onda empleada.
• Se la puede definir como el menor índice de refracción observado entre la preparación microscópica multiplicado por el seno del semiángulo de apertura del lente.
La resolución de un objetivo puede definirse por la sgte. ecuación:
R= K x l/NA K= a una constante de 0.61
l= es la longitud de onda.
• Los objetivos y los oculares están formados por un sistema de lentes de forma que puedan corregir sus defectos individuales (aberraciones). Aberraciones cromáticas
• Ocurre por que los lentes esféricos traen luz de menor longitud de onda para el enfoque mas cerca de la retina a diferencia de la longitud de onda mas larga. Consecuencia de esto es que se observan varias imágenes separadas y los detalles se ven borrosos. (los lentes acromáticos pueden corregir este defecto)
Aberraciones esféricas
• En estas aberraciones la calidad de la nitidez de la imagen se desvanece por que las propiedades ópticas del centro de la lente son diferentes de los de la periferia de esta. Los lentes apocromáticos corrigen tanto esta como la anterior aberración. Curvatura del campo
• Los lentes con esta aberración producen una imagen enfocada al centro y fuera de foco en la periferia y al cambiar el enfoque a la periferia se desenfoca el centro de la imagen.
Los lentes Planar, corrigen esta aberración. Sistema de lentes oculares.
• El ocular es el responsable del aumento de la imagen, éste va a estar dado por un sistema de lentes dado por oculares que son tubos huecos que tienen una lente superior e inferior planaconvexa (aumentos de 4x, 15x, 20x).

Objetivos.
• Son varios y adecuados al revolver porta objetivo; en la parte inferior tiene una lente frontal plano convexa, y en la superior una sucesión de lentes correctores.
• Los objetivos van a tener aumentos de 4x
(pequeño aumento), 10x (mediano aumento), 40x
(gran aumento), 100x (inmersión).
Nota.- El aumento del objetivo lo podemos
determinar al multiplicar el aumento del objetivo por el del ocular
.Subplatina. en la subplatina vamos a encontrar el condensador, que va a concentrar la luz para poder observar la imagen, tiene un tornillo que permite hacer ascenso y descenso.
• También vamos a tener al diafragma que es una serie de láminas sobrepuestas que se abren y cierran permitiendo el paso de luz; por debajo de este encontramos filtros que son de color azul que van a transformar la luz amarilla en luz blanca. En la parte inferior encontramos el espejo que puede ser plano con una cara cóncava. Aberraciones.
• Las aberraciones son los defectos que puede tener un microscopio óptico. Y vamos a tener las siguientes:
Aberración de esfericidad, cuando veamos nítido en la parte central y borroso en la periferia a la inversa.
Aberración cromática, donde el objeto de estudio se mantendrá del mismo color; pero el fondo será colorido, tendrá áreas de colores.

Cualidades del microscopio.-
Tenemos las siguientes:
Poder de definición: cuando no hay aberraciones, se ve nítido el objeto.
Poder de penetración: Es la capacidad de ver nuestro objeto de estudio sin tener que cambiar constantemente el foco.
Poder de resolución: es la capacidad de separar un punto hasta lo mínimo.

TIPOS DE MICROSCOPIO.
• Las unidades de medida utilizadas en histología son el nanometro (nm = 10-9 metros) y el micrómetro (mm = 10-6 metros.) Este término ha reemplazado al término «micra».
• La unidad Angström (10-10 metros) ya no es mas reconocida por el sistema Internacional de Unidades.
• Al microscopio de luz los tejidos son estudiados por transiluminación, las técnicas de preparación de tejidos se han desarrollado para obtener tejidos delgados y translúcidos, para que la preparación sea permanente se requiere que los tejidos sean fijados, extendidos en una placa de vidrio, coloreados o tejidos y cubiertos para su observación al microscopio.

FIJACION
• La fijación previene que el tejido siga su proceso natural de digestión ya sea por sus propias enzimas o por bacterias, y preserva la estructura física.
• Es por eso que las piezas de tejidos u órganos que se desea estudiar deben ser inmediatamente fijados luego de retirados del cuerpo.
• Normalmente la fijación consiste en sumergir el tejido en un líquido o pueden ser perfundidos.
• Las sustancias químicas que se utilizan para este fin son llamadas fijadores, algunas de estas sustancias son soluciones líquidas (Cloruro de mercurio, ácido pícrico, formalina, glutaraldehido)o combinación de uno o más sustancias fijadoras (Líquido de Bouin, compuesto por ácido pícrico, formalina, ácido acético y agua; y la formaliza de Zenker, que contiene formalina, dicromato de potasio, cloruro de mercurio y agua), el fijador mas comúnmente usado es la formalina al 10% disuelta en solución salina, y una solución buffer al 2% de glutarladehido.
• La química del proceso de fijación no esta muy bien comprendida, aunque se sabe que el formol y el glutaraldehido reaccionan con los grupos amino
(NH2) de las proteínas tisulares y pueden además entrecruzarse.
• La fijación del tejido para el estudio al microscópico electrónico requiere un proceso especial de doble fijación, usando una solución buffer de glutaraldehido seguida por una segunda solución fijadora de solución buffer de tetroxido de Osmio.

IMPREGNACION
• De manera de obtener cortes delgados con el micrótomo, los tejidos deben ser impregnados después de la fijación con sustancias que le den al tejido una consistencia rígida.
• Para que el tejido pueda ser impregnado se requiere de dos proceso previos que son la deshidratación y el aclaramiento.


COLORACION
• La coloración se la realiza utilizando diferentes colorantes o una mezcla de estos, que tiñen a los tejidos mas selectivamente.
• La coloración no solo permite la mejor observación de los tejidos, nos permite también distinguirlos entre ellos.
• Los colorantes se comportan como compuestos ácidos o básicos y tiene la tendencia de formar uniones electrostáticas con los radicales ionizables de los tejidos.
• Los compuestos que se tiñen con colorantes ácidos se los denomina acidófilos.

LA RADIOAUTOGRAFIA:
Propósito
• La radioautografía permite la localización de sustancias radioactivas en tejidos en forma de radiación emitida en emulsiones fotográficas.
• Las sales de Bromuro de plata presentes en la emulsión actúan como micro detectores de radioactividad.
• En la radioautografía, secciones de tejidos de animales previamente tratados con compuestos radioactivos son cubiertos con una emulsión fotográfica y guardadas en una caja a prueba de luz en el refrigerador.
• Por la localización de radioactividad en los componentes tisulares se puede obtener datos de la secuencia de eventos que ocurre en los tejidos.
• Por lo tanto, si una proteína radioactiva precursora (amino ácido) es dada a una célula que sintetiza proteínas su trayectoria puede ser seguida en la célula por mucho tiempo.

FRACCIONAMIENTO CELULAR
• El fraccionamiento celular es el proceso físico por lo cual se usa la fuerza centrifuga para separar organelos y componentes celulares como función de sus coeficientes de sedimentación.
• Con la centrifugación diferencial, los organelos celulares pueden ser aislados y sus funciones y composiciones químicos pueden ser determinados "in vitro".
• La centrifugación diferencial es lograda poniendo
una suspensión de componentes celulares (obtenido por la disyunción de células en un proceso llamado homogeneización) a la acción de diferentes fuerzas centrifugas resultando en la producción de fracciones puras que tienen diferentes organelos que pueden ser estudiadas bioquímicamente y su pureza analizada en el microscopio electrónico.
• La aislación de componentes celulares por el proceso de centrifugación diferencial permite el estudio en detalle de los componentes celulares obtenidos en un estado relativamente puro: ejemplo: núcleo - nucleolo - mitocondria - retículo endoplásmico rugoso - ribosomas - gránulos de secreción y gránulos de pigmento.

HISTOQUIMICA Y CITOQUIMICA
• La histoquímica y la inmunohistquímica unen los métodos histológicos y citológicos con los de la química y la bioquímica.
• Su objetivo es mostrar la composiciòn química y bioquímica de los tejidos y células más allá de la distribución ácido-básica mostrada mediante los métodos de tinciòn standard, sin alterar la distribución de las sustancia químicas.
• Los términos histoquímica y citoquímica son usados principalmente para indicar los métodos
y para localizar diferentes sustancias en secciones de tejidos.
• Muchos iones (ejemplo hierro-fosfato) fueron localizados en el tejido con estos métodos.
• La identificación de moléculas orgánicas por reacciones químicas es explicada de la siguiente manera:

ACIDOS NUCLEICOS
• El DNA puede ser identificada y cuantificada en los núcleos celulares usando la "reacción Feulgen" que produce un color rojo en la presencia de DNA.

PROTEINAS
• Los métodos químicos no permiten la localización de proteínas específicas en células y tejidos, los métodos inmunohistoquímicos pueden.

POLISACARIDOS Y OLIGOSACARIDOS
• Polisacáridos en el cuerpo están en un estado libre o combinados con y lípidos.
• Un polisacárido en el cuerpo unido a una proteína o lípido - se llama glucógeno - que puede ser demostrado en la reacción ácida periódica de Schiff (PAS) (periodic acid-Sciff reaction-PAS).
• La reacción PAS basada en la acción oxidativa del ácido periódico (HIO4) en los grupos 1 y 2- glicolos que están presentes en los residuos de glucosa da origen a los grupos aldehidos que se reaccionan con el reactivo de Schiff produciendo un compuesto nuevo y complejo de color púrpura.
• Una variedad de polisacáridos que son fuertemente aniónicos y de cadena larga que contienen monosacáridos aminados (amino azucares) constituye los glucosaminoglucanos.

LIPIDOS
• Lípidos son mejor revelados con tintes que son más solubles en lípidos que en el medio en que la tinción esta disuelta.
• En este proceso secciones congeladas son sumergidos en soluciones alcohólicas que están saturadas con la tinción apropiada.
• Luego la tinción va desde el alcohol a las gotas
lípido celulares.
• Los tintes más comunes son Sudan IV y Sudan negro - ellos confieren los colores rojo y negro respectivamente en los lípidos.
• Muchos procedimientos histoquímicos son usados frecuentemente en diagnósticos laboratoriales: la reacción Perl para hierro - el PAS-amilasa y reacciones azul alcian para glucógeno y glucosaminoglucanos y las reacciones para lípidos son frecuentemente usadas en las biopsias de tejidos tomados de pacientes con enfermedades que almacenan hierro (ejemplo hemocromatosis y hemosiderosis) glucógeno (glucogenosis) glucosaminoglucanos
(mucopolisacaridosis) y esfingolípidos
(esfingolipidosis) en tejidos.

ENZIMAS
• Una variedad de métodos histoquímicos son usados para revelar e identificar enzimas. La mayoría de los procedimientos enzimáticos histoquímicos están basados en la producción de tinturas intensas o de precipitados "electron- densos" en el área de actividad enzimatica.

FOSFATASA ACIDA
• El método Gomori demostrativo de la actividad del ácido fosfórico consiste en incubar secciones de tejidos fijados en formol en una solución que contiene glicerofosfato de sodio y nitrato de Plomo con una lámina protectora de ph 5-0. Este método permite la localización de la actividad de estos enzimas y se usa frecuentemente para demostrar los lizosomas que son organismos citoplasmáticos que contienen ácido fosfático.

DEHYDROGENASAS
• Estos enzimas remueven el hidrógeno de una sustancia y lo transfieren a otra.

PEROXIDASAS
• Estas enzimas que están presentes en muchos tipos de células promueven la oxidación de ciertas con la transferencia de iones de hidrógeno a peróxido de hidrógeno formando moléculas de agua.

INMUNOCITOQUIMICA
• La gran afinidad de interacción entre macromoléculas es la base de técnicas importantes como la histoquímica de la lectina, la inmunohistoquímica y la hibridación "in situ."
• Este método permite el estudio de la presencia y la actividad de macromoléculas específicas en las células y en los tejidos.
• El mejor ejemplo de este estudio es la interacción del anticuerpo antígeno.
• Los métodos que usan anticuerpos específicos han probado ser los más importantes en la localización de específicas y otras macromoléculas como el ácido nucleico y los polisacáridos.
• Estos exámenes están basados en la reacción del cuerpo cuando está expuestos a sustancias extrañas que se llaman antígenos o inmunógenos.
• El cuerpo responde produciendo (anticuerpos) que reaccionan en forma específica que se unen fuertemente al antígeno y así neutralizan la sustancia extraña.
• Esta producción ayuda al organismo a luchar contra la invasión de microorganismos extraños
y a eliminar ciertas y otras materias extrañas no reconocidas como propias. La inmunocitoquímica está basada en el matrimonio de inmunoglobulinas con sustancias que las hacen visibles en el microscopio sin causar la pérdida de actividad biológica del anticuerpo.

METODO PARA IDENTIFICAR ANTICUERPOS UNIENDOLOS CON UN COMPUESTO FLUORESCENTE
• Esto permite la identificación en el área de antígenos específicos usando un microscopio fluorescente.

UNIENDOLOS CON UN ENZIMA:
• Esto permite la detección del anticuerpo identificado por usos convencionales de citoquímica enzimática, uniéndolo con compuesto de electrones dispersos que puede ser detectado por microscopios de luz y electrónicos.
• Las partículas de oro pueden observarse fácilmente en ambos tipos de microscopios y son actualmente los más usados.

METODOS DE LOCALIZACION DE ANTIGENOS:
• Hay dos clases de métodos directos e indirectos y son por inmunocitoquímica.

METODO DIRECTO:
• Consta de cortes de tejidos que se sospeche que contienen un antígeno, (proteína X) Estos son incubados con un anticuerpo específico a X y el anticuerpo se combina con el X.

METODO INDIRECTO:
• Los anticuerpos de la proteína X son producidos en un animal. (ejemplo - conejo) Este método tiene la ventaja que su técnica es mucho más sensible.

TECNICAS DE HIBRIDIZACION "IN SITU"
• El objeto de esto es el entendimiento de como
trabaja la célula en detalle.
• La hibridación se refiere a la unión de secuencias complementarias de nucleótidos entre si con alta especialidad.
• Estas técnicas incluyen el análisis Sureño que caracteriza y da la cantidad de presencia de DNA de un gen específico en la presencia de otros genes en un organismo ecarióico; análisis Norteño identifica y cuantifica transcripciones específicas del mRNA en la presencia de transcripciones de RNA que se expresan dentro de una célula y análisis occidental - que detecta una sola proteína de entre todas las otras existentes en una sola célula o tejido.
• Los análisis Sureño y Norteño están basados en la gran afinidad que hay entre secuencias complementarias del ácido nucleico.
(hibridación).• La hibridación del ácido nucleico es la técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA o RNA basadas en la habilidad de un solo segmento del ácido nucleico que se une específicamente al segmento gemelo de ácido nucleico previamente identificado y conocido.
• Estas secuencias producidas en el laboratorio se llaman "probes" y son identificadas por radioisótopos o por la unión de los Nucleótidos con biotina.
• Esto puede ser detectado por la radioautografía y también por avidin por su gran afinidad.
• Para localizar secuencias específicas de DNA
(genes) o mensajeros de RNA en CELULAS o componentes celulares se puede aplicar la hibridación "in situ" a los cortes de tejidos,
"extendidos" o frotis, cromosomas de células mitóticas aplastadas.
• Esto permite la localización específica de DNA
(genes celulares o virales) o también expresión genética a través de la presencia de mRNA en células completas o componentes celulares.

QUIMICA HISTOLECTINA
• Las lectinas son que se derivan de semillas de plantas que se unen a los carbohidratos de las superficies celulares con gran afinidad y especialización.
• Diferentes clases de lectinas se unen a secuencias específicas de residuos de azúcar.
• Se unen a la superficie celular de las glucoproteinas proteoglucanos y glucolípidos y son usadas para diferenciar las moléculas de la membrana que contienen secuencias específicas de residuos de azúcar.
• Las lectinas son identificadas con "peroxidasa" para ser posible su identificación y localización por medio de técnicas histoquímicas de "peroxidasa."